Advanced materials | 直接3D生物打印hiPSC来源的心肌细胞生成功能性心脏组织

埃尔朗根大学Felix B Engel教授在《Advanced materials》上发表论文“Direct 3D-Bioprinting of hiPSC-Derived Cardiomyocytes to Generate Functional Cardiac Tissues”，他们提出一种直接3D生物打印方法，将人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的心肌细胞嵌入胶原透明质酸墨水中，以准确和可重复的方式产生厘米大小的功能性环和心室形状的心脏组织，最终，打印物能够表现出类似心脏的功能，能培养至少100天并对药物刺激做出反应。

hiPSC来源的心肌细胞是由人诱导多能干细胞（hiPSC）分化而来的心肌细胞（hiPSC-CMs），能表现出收缩和响应电信号等特性。hiPSC来源的心肌细胞具有潜在的重要应用价值，尤其在心脏疾病治疗和研究方面，可用于疾病建模、药物发现、个性化医疗等应用。

生物制造的一个目标是设计组织、器官其一部分来研究或治疗当前治疗方法有限的疾病。目前主要用的生物制造方法，一种是无细胞3D支架，但有一个主要缺点是难以将细胞定殖，特别是以有组织的方式定殖。另一种方法是铸造含有细胞的水凝胶，然而这种方法不允许制造层次结构。目前，3D生物打印技术有希望解决传统生物制造面临的主要瓶颈和当前问题，3D生物打印能保证细胞在整个构建过程中均匀分布，能直接制造具有生理功能的组织，允许制造传统方法难以实现的复杂生物结构，能根据具体需求定制个性化组织结构。

微粒以圆形为主，部分呈椭圆形，通过离心压实时，微粒形成具有自愈特性的支撑浴，允许打印喷嘴自由通过。即使倒置容器，支撑浴中的染料也能保持在原位。为证实这些观察现象，作者进行了流变分析。结果表明在测试的整个频率范围内，支撑浴在低应变下表现出固体样流变行为以及剪切稀化行为，在交替剪切速率下，支撑浴表现出近乎瞬时和完全的恢复行为。综合来说，作者开发出一种简单的方法来生产具有自修复特性的支撑浴，可用于凝胶打印。

作者用不同浓度的胶原墨水打印脱细胞环状结构评估胶原蛋白在上述支撑浴中的可打印性，此外，还添加透明质酸(HA)到胶原蛋白中，以改善生物墨水的可打印性。为了确定打印环的均匀性和打印过程的可重复性，团队从多个打印环的图像生成重叠图来评估。随着胶原蛋白含量的增加，重叠图显示出更均匀的打印环，边界更光滑。此外，随着胶原浓度的增加和透明质酸的加入，强度谱显示出更小的差异，变得更加明确。作者最终选择了由3.0 mg/ml胶原-i和3.0 mg/ml HA (CollHA3-3)组成的生物链进行进一步的研究，该数据拥有最高的再现性以及对挤出速度的最佳控制，且打印出的环结构壁厚较薄。

为了产生有层次结构的组织或器官，控制细胞分布很重要。为了评估细胞的添加是否会影响墨水的可打印性，作者将25 Mio/ml hiPSC-CMs加入到CollHA3-3墨水中，用于打印环状组织。结果表明打印环的结构稳定，并表现出良好的均匀性。在组织构建后(第0天)和制造后7天（第7天)对打印的组织和滴铸形成的组织进行染色。结果发现，在任何时间点，铸型组织和打印组织的活力无显著差异。而第30天，打印的hiPSC-CMs显示出典型的肌合成α-肌动蛋白条纹，以及缓慢的骨骼肌钙蛋白-i (ssTnI)和心脏肌钙蛋白-i (cTnI)。45个打印组织中在第3天已经表现出了自发的同心收缩。通过Fluo-4荧光强度的增强和减弱反映了打印组织在收缩周期中表现出钙的同步流入和流出。测量不同区域的荧光强度可以识别出起搏中心，其行为随着时间的推移显示出高同步性，远处区域达到荧光强度峰值的延迟约为100 ms(1帧)。这进一步证明了hiPSC-CMs在打印组织内形成了相互连接的网络。

为了检验打印环是否可以施加类似于心脏的同心圆力，作者设计并制造了由六个柔性柱组成的阵列。第1天将打印的环转移到柱阵列上，并在柱子周围压实，培养至第30天在收缩周期中，打印的环能够同步使所有6根柱子偏移，这说明它们能够对阻力施加类似的同心圆力。

作者设计并打印了一个高度为14 mm，最宽处直径为8 mm的心室模型，测试他们的方法是否能够实现人类心脏心室功能模型的3D生物打印。打印心室在制造7天后，形态稳定不变并发生了自发的同步收缩，表达出了与心室功能相关的产物。最后作者通过实验表示打印模型的培养时间至少可以达到100天。有希望在未来打印并培养出可用于人类使用的人工3D生物打印培养心脏心室。